Νανοτεχνολογία και Φωτοδυναμική θεραπεία καρκίνου

Abstract

Η Φωτοδυναμική θεραπεία είναι μια σύγχρονη και επιλεκτική μέθοδος για την αντιμετώπιση του καρκίνου και άλλων μη καρκινικών παθήσεων, η οποία συνδυάζει τρεις παράγοντες: το φως, έναν φωτοευαισθητοποιητή και το οξυγόνο. Ο καθένας από αυτούς τους παράγοντες από μόνος του είναι αβλαβής, αλλά όταν συνδυάζονται, μπορούν να προκαλέσουν κυτταρικό θάνατο. Ο φωτοευαισθητοποιητής είναι ένα χημικό μόριο που απορροφάται επιλεκτικά από τους πάσχοντες ιστούς, ενώ τα οξειδωτικά προϊόντα που παράγονται κατά τις φωτοχημικές αντιδράσεις τύπου Ι και ΙΙ οδηγούν στη νέκρωση των καρκινικών κυττάρων. Το κύριο πλεονέκτημα της φωτοδυναμικής θεραπείας, σε σύγκριση με τις παραδοσιακές αντικαρκινικές θεραπείες, είναι η επιλεκτικότητά της η οποία οφείλεται: α) στην επιλεκτική συσσώρευση του φωτοευαισθητοποιητή στους πάσχοντες ιστούς, β) στην κατευθυνόμενη εφαρμογή του φωτός στις καρκινικές περιοχές και γ) στη δράση των οξειδωτικών προϊόντων τοπικά, χωρίς να επηρεάζονται υγιείς ιστοί. Παρά τα πλεονεκτήματα της μεθόδου, η εφαρμογή της περιορίζεται, κυρίως λόγω της δυσκολίας εφαρμογής της σε όγκους που βρίσκονται σε εσωτερικά όργανα. Επιπλέον, η παραμένουσα φωτοευαισθησία αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για την αποδοχή της θεραπείας, καθώς η ακούσια διέγερση του φωτοευαισθητοποιητή από το φυσικό φως μπορεί να προκαλέσει την καταστροφή του δέρματος και των ματιών. Η αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος και η βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας μπορούν να ενισχυθούν μέσω της Νανοτεχνολογίας. Η δημιουργία νανοσωματιδίων μεταφοράς των φωτοευαισθητοποιητών αποτελεί καινοτομία που μπορεί να βελτιώσει την δράση της φωτοδυναμικής θεραπείας. Οι περισσότερες φωτοευαίσθητες ουσίες είναι υδρόφοβες, γεγονός που περιορίζει τη διαλυτότητά τους σε υδατικά διαλύματα άρα και την φωτοδυναμική τους δράση. Ο εγκλεισμός τους σε νανοσωματίδια μπορεί να βελτιώσει τη διαλυτότητά τους και να αυξήσει τη βιοδιαθεσιμότητά τους. Ένας τύπος νανοσωματιδίων που παρουσιάζει ενδιαφέρον είναι οι κυκλοδεξτρίνες, οι οποίες μπορούν να ενισχύσουν τη διαλυτότητα των υδρόφοβων φωτοευαισθητοποιητών και να παρατείνουν τη διάρκεια ζωής τους στον οργανισμό, προστατεύοντάς τους από την αποδόμηση και αυξάνοντας την επιλεκτικότητά τους ως προς τα καρκινικά κύτταρα. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής τέθηκαν επιμέρους στόχοι που αφορούσαν: α) την ανάπτυξη νανοσωματιδίων μεταφοράς από φυσικές και χημικά τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες για τον φωτοευαισθητοποιητή δεύτερης γενιάς SiCl2Pc, και β) τη συγκριτική μελέτη των φωτοφυσικών και φωτοχημικών ιδιοτήτων της εγκλεισμένης και ελεύθερης φθαλοκυανίνης SiCl2Pc. Η παρούσα μελέτη επιδιώκει να διερευνήσει αν η ενσωμάτωση της φθαλοκυανίνης στις κυκλοδεξτρίνες: α) επηρεάζει τις φωτοφυσικές και φωτοχημικές ιδιότητες της SiCl2Pc, β) μειώνει ή αποτρέπει τη συσσωμάτωση των μορίων της, γ) αυξάνει την υδατοδιαλυτότητα της, και δ) ενισχύει τη φωτοδυναμική της δράση σε καρκινικά κύτταρα της σειράς Α431 του δέρματος. Στη σύγχρονη βιβλιογραφία, δεν υπάρχει μελέτη της φωτοδυναμικής δράσης του SiCl2Pc σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, ούτε έχει εγκλειστεί ο συγκεκριμένος φωτοευαισθητοποιητής σε νανοσωματίδια κυκλοδεξτρίνης. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται πολλές διαφορετικές μέθοδοι για τη δημιουργία συμπλόκων εγκλεισμού. Στην παρούσα διατριβή, η τεχνική που επιλέχθηκε για τη δημιουργία των νανοσωματιδίων ήταν η μέθοδος kneading, η οποία θεωρείται ιδανική για τον εγκλεισμό υδρόφοβων μορίων όπως οι φθαλοκυανίνες. Η επίτευξη υψηλής απόδοσης εγκλεισμού είναι κρίσιμη για την ενίσχυση των θεραπευτικών αποτελεσμάτων κατά τη φωτοδυναμική θεραπεία, και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τα χαρακτηριστικά των μορίων που εγκλείονται. Οι φθαλοκυανίνες, λόγω της έντονης υδροφοβικότητας και του μεγάλου μοριακού τους μεγέθους, εμφανίζουν περιορισμένη ικανότητα να εγκλειστούν αποτελεσματικά σε νανοσωματίδια. Παρά τις προκλήσεις αυτές, ο εγκλεισμός της SiCl2Pc στις κυκλοδεξτρίνες επιτεύχθηκε, με σημαντική αύξηση της απόδοσης εγκλεισμού όταν χρησιμοποιήθηκε γ-κυκλοδεξτρίνη, γεγονός που καταδεικνύει τη σημασία του μεγέθους της κοιλότητας στην απόδοση. Για τον χαρακτηρισμό των νανοσωματιδίων, μετρήθηκαν το μέγεθος, ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI) και το ζ-δυναμικό με τη μέθοδο δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS), ενώ οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της εκάστοτε κυκλοδεξτρίνης με την φθαλοκυανίνη, καθώς και η δομή των συμπλόκων, μελετήθηκαν με φασματοσκοπία FT-IR. Οι φωτοφυσικές μελέτες κατέδειξαν ότι ο εγκλεισμός της SiCl2Pc στις φυσικές και τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες μείωσε τη συσσωμάτωση της στα υδατικά διαλύματα διατηρώντας τα φωτοφυσικά της χαρακτηριστικά χωρίς να επηρεάζεται η κβαντική απόδοση ή η φωτοδυναμική της ικανότητα. Οι φωτοχημικές μελέτες έδειξαν ότι η SiCl2Pc είναι χημικά σταθερή τόσο στην ελεύθερη όσο και στην εγκλεισμένη της μορφή. Επίσης, μελετήθηκε η ικανότητα παραγωγής ελεύθερων ριζών (ROS) των πέντε φωτοευαισθητοποιητών σε υδατικό διάλυμα. Τελικά, τα σύμπλοκα εγκλεισμού της φθαλοκυανίνης κατάφεραν να μειώσουν την συσσωμάτωσή της βελτιώνοντας την παραγωγή ελευθέρων ριζών, καθιστώντας τα σύμπλοκα αποτελεσματικά για φωτοδυναμικές εφαρμογές. Από τις μελέτες φωτοδυναμικής δράσης της ελεύθερης και εγκλεισμένης στις κυκλοδεξτρίνες SiCl2Pc, τα νανοσωματίδια παρουσίασαν ισχυρότερη φωτοδυναμική δράση συγκριτικά με την ελεύθερη μορφή. Αυτό αποδίδεται κυρίως στην αυξημένη διαλυτότητα του φωτοευαισθητοποιητή στο υδατικό περιβάλλον, η οποία προήλθε από την ενθυλάκωσή του στις κυκλοδεξτρίνες. Η βελτιωμένη διαλυτότητα και η μείωση της συσσωμάτωσης των μορίων αύξησαν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση του φωτοευαισθητοποιητή και ενίσχυσαν την κυτταροτοξικότητά του στις ίδιες πειραματικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, τα σύμπλοκα της φθαλοκυανίνης με τις κυκλοδεξτρίνες β-CD και HP-β-CD παρουσίασαν σημαντική κυτταροτοξικότητα ακόμα και στις χαμηλότερες δόσεις ενέργειας, με την SiCl2Pc-β-CD να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική, ενώ τα σύμπλοκα με τις Me-β-CD και γ-CD δεν εμφάνισαν σημαντικά αποτελέσματα σε χαμηλές δόσεις, αλλά έγιναν πιο αποτελεσματικά με την αύξηση της ισχύος ακτινοβόλησης, με το σύμπλοκο SiCl2Pc-γ-CD να ξεχωρίζει. Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωτοδυναμική δράση της ελεύθερης SiCl2Pc και των συμπλόκων με τις Me-β-CD και γ-CD ήταν δοσο-εξαρτώμενη: με την αύξηση της δόσης ενέργειας, αυξήθηκε και ο κυτταρικός θάνατος. Αντίθετα, τα σύμπλοκα με τις β-CD και HP-β-CD εμφάνισαν inverse dose dependent photodynamic effect, δηλαδή η αύξηση της ισχύος ακτινοβόλησης μείωσε τη φωτοδυναμική δράση. Αυτό το φαινόμενο, παρόλο που έχει παρατηρηθεί και στη βιβλιογραφία, δεν είναι πλήρως κατανοητό. Τέλος, η μελέτη του επαγόμενου οξειδωτικού stress 0 και 24 ώρες μετά τη φωτοδυναμική θεραπεία επιβεβαίωσε το inverse dose dependent photodynamic effect για τους φωτοευαισθητοποιητές SiCl2Pc-β-CD και SiCl2Pc-HP-β-CD. Αυτός ο μηχανισμός ενδεχομένως να περιορίζει την παρατεταμένη φωτοευαισθησία που μπορεί να παρατηρείται μετά τη θεραπεία, καθιστώντας αυτά τα σύμπλοκα πιο ασφαλή για κλινική χρήση. Η SiCl₂Pc, αν και διαθέτει σημαντικές δυνατότητες ως φωτοευαισθητοποιητής λόγω της χημικής της δομής, έχει παραμείνει ανεξερεύνητη στη φωτοδυναμική θεραπεία κυρίως λόγω της υδροφοβικότητάς της. Η παρούσα διατριβή καλύπτει αυτό το κενό στη βιβλιογραφία, συμβάλλοντας στην κατανόηση της φωτοδυναμικής δράσης των φθαλοκυανινών πυριτίου, ενώ αναδεικνύει τη σημασία της ενθυλάκωσης της SiCl₂Pc σε νανοσωματίδια μεταφοράς, όπως οι κυκλοδεξτρίνες. Η μελέτη της φωτοδυναμικής δράσης της SiCl₂Pc σε καρκινικά κύτταρα A431, τα οποία υπερεκφράζουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), προσθέτει μια σημαντική διάσταση στην έρευνα. Η υπερέκφραση του EGFR συνδέεται με την επιθετική ανάπτυξη όγκων και αντίσταση στις θεραπείες, καθιστώντας τα κύτταρα αυτά κατάλληλο μοντέλο για την αξιολόγηση της PDT σε καρκίνους που εμφανίζουν παρόμοια χαρακτηριστικά. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής ανοίγουν νέους δρόμους για τη χρήση παραγώγων της φθαλοκυανίνης πυριτίου, υποδεικνύοντας ότι η ενθυλάκωση σε κυκλοδεξτρίνες θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για υδρόφοβα μόρια που μέχρι τώρα δεν είχαν μελετηθεί λόγω προβλημάτων διαλυτότητας.